我们对CAR-T细胞治疗的认知又要被刷新了。来自宾夕法尼亚大学医学院的J. Joseph Melenhorst和免疫治疗学大牛Carl H. June团队，在顶级期刊《自然医学》上发表了一个令人震惊的CAR-T细胞治疗后复发的临床案例[1]。
在给一名身患复发/难治性B细胞急性淋巴细胞白血病（B-ALL）的患者生产CAR-T细胞时，那个本该加到T细胞上，帮助T细胞特异性识别CD19、并抓住癌细胞的CAR（嵌合抗原受体），意外地被加到患者癌变的B细胞上，形成了“CAR-癌细胞”。更让研究人员震惊的是，加到癌细胞上的CAR会与癌细胞表面的CD19结合，让CAR-T细胞失去了识别癌细胞的靶标。这名患者在接受CAR-T治疗的261天之后，由于“CAR-癌细胞”大量增殖，癌症复发；最终死于与白血病相关的并发症。
这个研究不仅报告了一个之前从没有遇见过的CAR-T治疗风险；也直接证明了癌症干细胞存在于人体的假说，因为研究人员发现导致患者死亡的CAR-癌细胞，都来自于同一个被编辑的癌细胞。实际上，这是Carl H. June团队在短短4个月之内报告的第二个罕见CAR-T治疗病例了。
早在今年5月31日，June团队《自然》杂志上发表一篇论文称，他们在给一名患者制作CAR-T时，有一个CAR序列被无意插入到了TET2基因中，导致了该基因功能障碍[2]。正是这个意外地插入，赋予了这个CAR-T细胞超能力，让它增殖能力更强、抗癌能力更强、活得也更久。最终在这个TET2被插入失活的CAR-T帮助下，那名慢性淋巴细胞白血病（CLL）患者的病情得到了长期的控制，截止论文发稿时，那名患者已经生存了5年。
与4个月之前的那个78岁的患者相比，本次研究汇报的这名20岁的患者就没那么幸运了。这名20岁的B-ALL患者，在做完第三次化疗和脐带血移植之后，病情又复发了。走投无路之下，他参与了宾大组织的CAR-T（CTL019）细胞治疗I期临床研究（NCT01626495）。医务人员从他身上获取T细胞，并制作成CTL019细胞。在接受淋巴清除之后，患者被注射了20亿个T细胞，其中有治疗作用的CTL019细胞有4.8亿个。CTL019细胞回输的28天之后，患者的病情就完全缓解了，不得不说CAR-T的威力还是很厉害的。在回输后的第252天，研究人员例行检查患者外周血中CTL019细胞数量的时候，基因测序结果表明，外周血中的CAR在暴增。奇怪的是，当他们用流式细胞技术在外周血中找CAR-T的时候，却没发现CAR-T有增多的迹象。在血液中检测到了大量的CAR基因，却没有发现CAR-T。这种现象让研究人员感到困惑。到回输后的261天时，患者疾病突然复发，分析发现导致患者病情复发的癌细胞，90%检测不到CD19。当研究人员再去检查那些携带CAR的“T细胞”时，他们看到了让他们震惊的结果：那些携带CAR的细胞，竟然不是T细胞，竟然是癌变的B细胞。反应过来的研究人员迅速制定了新的治疗方案。遗憾的是，他们最后没能阻止“CAR-癌细胞”的脚步，患者最终死于白血病相关的并发症。携带CAR的癌细胞究竟是从哪里来的？他们与患者的病情复发又是啥关系？通过给CAR-癌细胞测序，及分析患者一直以来的回输数据，研究人员最终确定，癌变B细胞里的CAR是制作CTL019细胞时意外引入的。而且起始的那个癌细胞里面整合进去了两个CAR，不过，这两种不同的插入方式，均没有影响这两个基因的表达。说明，这两种插入方式与患者的癌症复发应该是无关的。当研究人员回过头在制备好的CTL019细胞里面寻找时，并没有找到有上述两种特征的细胞存在。这表明，初始的“CAR-癌细胞”含量是非常非常少的，以至于现有手段不能检测。进一步的研究也证实，所有的“CAR-癌细胞”都来拥有同一个祖先。也就是说，患者体内的所有“CAR-癌细胞”都是那唯一一个被编辑的癌变B细胞增殖来的。
研究人员是先观察到患者体内CAR异常高表达，然后发现CD19阴性的癌细胞大量增殖。这二者之间是否存在什么关系，CTL019的靶标CD19又究竟去哪里了？之前有研究表明，癌细胞表面的CD19的缺失，可能是CD19发生了突变[3]，或者可变剪切[3]，或者是B细胞受体复核蛋白CD81发生突变[4，5]导致的。不过，研究人员在患者体内并没有发现上述现象。更奇怪的是，在mRNA水平居然发现了CD19。这暗示CD19可能还在细胞表面，只是因为某种原因，用流式细胞仪发现不了了。于是研究人员就想到了一种靶向CD19细胞内部分的抗体OTI3B10。通过免疫组织化学染色，研究人员确实发现，在导致患者白血病复发的CD19“阴性”癌细胞上，确实存在CD19。此时，谜底呼之欲出。大概率是癌细胞表达的CAR与癌细胞表面的CD19自行结合了，把CD19遮住了。为了证实这一猜想，研究人员使用结合CAR和CD19 的两种特异性抗体，结合共聚焦显微技术，发现CAR和CD19确实是在一起的。难怪流式细胞术检测不到细胞表面的CD19。实际上，不仅流式细胞术难以发现这种CAR-癌细胞，连靶向CD19的CAR-T也难以发现CAR-癌细胞了。也就是说，癌变的B细胞意外获得了对CAR-T的耐药性。癌变的B细胞自己获得了CAR，随便把CD19遮挡了，CAR-T没机会识别癌细胞了。为了进一步确定这个结果，研究人员重新人为让癌变的B细胞表达CAR，再次证实癌细胞表达的CAR确实会与自身的CD19结合，阻挡了CAR-T对癌细胞的识别。同时研究人员还证实，这种遮蔽现象不仅仅是CD19特有的，CD22也会出现这种现象。这意味着这种对CAR-T治疗的抗性，可能是所有CAR-T治疗都要面对的问题。在发现这个现象之后，研究人员迅速分析了全球范围内接受CTL019治疗的所有369例患者的数据，幸运的是，在其他患者体内没有发现这种超级“CAR-癌细胞”的出现。最后，这个临床案例还让研究人员在人体内证实了一个假说：癌症干细胞假说。因为通过分析所有的数据发现，导致这名患者癌症复发的癌细胞，来自于同一个被意外加上CAR的癌变B细胞。即，一个超级癌细胞就能足以产生致命的癌症[6]。把5月份的研究和这个研究放在一起看，不难发现CAR-T的制作仍旧充满了不确定。有可能因为分离的T细胞不纯，导致“CAR-癌细胞”出现；也有可能因为脱靶问题，CAR插到了其他的位点。这些都足以让CAR-T制造企业提高警惕，在插入CAR的时候尽可能地清除癌细胞，降低脱靶效应。
参考资料：[1] Induction of resistance to chimeric antigen receptor T cell therapy by transduction of a single leukemic B cell[J]. Nature medicine, 2018.
[2] Disruption of TET2 promotes the therapeutic efficacy of CD19-targeted T cells[J]. Nature, 2018: 1.
[3] Convergence of Acquired Mutations and Alternative Splicing of CD19 Enables Resistance to CART-19 Immunotherapy[J]. Cancer Discovery, 2015, 5(12): 1282-1295.
[4] CD81 gene defect in humans disrupts CD19 complex formation and leads to antibody deficiency.[J]. Journal of Clinical Investigation, 2010, 120(4): 1265-1274.
[5] Resistance to anti-CD19/CD3 BiTE in acute lymphoblastic leukemia may be mediated by disrupted CD19 membrane trafficking[J]. Blood, 2017, 129(1): 100-104.
[6] https://www.nytimes.com/2018/10/01/health/leukemia-immunotherapy-kymriah.html